Изменяя те или иные параметры среды, включая в модельное сообщество различные виды водорослей, можно получать ответы на разные вопросы. Так, к примеру, лабораторные альгоценозы незаменимы при изучении влияния лимитирующих факторов на функционирование экосистем, при проведении токсикологических экспериментов, при разработке новых методов контроля численности фитопланктона и пр. При работе с микрокосмами в лабораторных условиях полностью исключается опасность необратимого воздействия на экосистемы и загрязнения окружающей среды.

В лабораторных экспериментах альгоценозы всегда находятся в контролируемых условиях. Обычно контролируются температура, освещенность, содержание биогенных элементов (азота и фосфора) в среде, бактериальная чистота культур микроводорослей. Это позволяет исследователю изучать влияние тех или иных параметров на развитие и функционирование сообществ, сохраняя необходимые для каждого конкретного случая внешние условия. В зависимости от целей и задач опыта условия могут оставаться постоянными или изменяться по ходу эксперимента в соответствии с планом, составленным заранее. При работе с природными экосистемами в полевых условиях такая возможность практически всегда отсутствует. Использование лабораторных микрокосмов существенно облегчает задачу постановки длительных и многофакторных экспериментов, позволяет использовать различные концентрации изучаемых веществ, изучать влияние разнообразных загрязнений, определять допустимые уровни воздействия и т.д.

С помощью искусственных лабораторных сообществ можно проверить на практике различные математические модели природных экосистем, создавая условия, соответствующие тем или иным временным отрезкам вегетационного периода, различным календарным годам и климатическим изменениям.

Таким образом, мы можем перечислить основные задачи, решаемые с помощью лабораторных альгоценозов:

1. изучение динамики и кинетики роста и потребления;
2. изучение взаимодействия видов;
3. исследование принципов лимитирования;
4. изучение воздействия различных факторов окружающей среды на функционирование и развитие экосистем;
5. изучение парциальных потребностей, знание которых необходимо для построения математических моделей (см. подробнее гл. 4);
6. идентификация и верификация математических моделей в лабораторных условиях;
7. решение задач управления и оптимизации, испытание различных методов управления альгоценозами.

В практике лабораторных экспериментов существует два основных типа культивирования искусственных микрокосмов (называемых также лабораторными поликультурами водорослей, или лабораторными альгоценозами): проточный (непрерывный) и накопительный. В первом случае система представляет собой культуру, находящуюся в состоянии динамического равновесия по содержанию питательных веществ и концентрации клеточного материала. Для сохранения такого равновесия необходим постоянный приток биогенных элементов и удаление избытков биомассы фитопланктона. Поэтому проточные культуры представляют собой открытые системы, обменивающиеся с внешней средой энергией и веществом.

Накопительное культивирование не предусматривает притока минеральных веществ и отвода органических веществ. Характер функционирования накопительных культур полностью задается начальными условиями среды и освещенности. В результате роста водорослей в среде происходят некоторые изменения: уменьшается концентрация биогенов, изменяется кислотность, накапливаются продукты обмена. При определенных условиях может произойти смена лимитирующего биогена, а при достижении высоких плотностей наблюдается самоингибирование. Рост водорослей в накопительных культурах — сложный и многоступенчатый процесс, который состоит из нескольких последовательных стадий (гл. 2). В целом время жизнедеятельности накопительных культур ограничено и зависит от скоростей исчерпания субстратов и роста водорослей, поскольку мы имеем дело с замкнутыми экосистемами, которые не обмениваются веществом с внешней средой.

Существует достаточное количество работ, в которых изучалось совместное культивирование видов водорослей (Баранов и др. , 1964; Левина, 1964; Гельфанд и др. , 1973; Tilman, Kilham, 1976); основное внимание в них уделено исходу конкурентной борьбы между видами за биогенные элементы. Между тем интересен и другой круг вопросов: может ли существовать поликультура из большого числа видов, можно ли рассматривать многовидовую смешанную культуру водорослей как целостное сообщество, как быстро оно складывается, насколько устойчиво и как долго может существовать в лабораторных условиях?

Перед экспериментом водоросли обычно проходят некоторый отбор — проверяется возможность их роста на выбранной среде при конкретных условиях освещенности и температуры; скорости роста этих видов не должны различаться очень сильно. В целостном сообществе предполагается наличие взаимосвязи между образующими его видами, которая может осуществляться либо через метаболическое взаимодействие, либо через субстратное (поскольку водоросли потребляют биогены из одной и той же среды), либо через оба взаимодействия вместе. Возможно, что доля того или иного способа взаимодействия может меняться по мере роста поликультуры. Чтобы обнаружить эти способы взаимодействия, можно сравнивать поликультуру с мысленным объединением монокультур как с условным сообществом, в котором виды не взаимодействуют друг с другом, а соотношение численностей отражает лишь разницу в скоростях роста видов при данных условиях. Если соотношение численностей видов или других целостных характеристик сообщества, например ранговых распределений (Левич, 1980), в поликультуре такое же, как и в сумме монокультур, то следует полагать, что нет ни субстратного, ни метаболитного взаимодействия, и поликультура в указанном смысле не является целостным сообществом. Видимо, это может наблюдаться в начале эксперимента, когда биогенов много, а водорослей мало. Если ранговые распределения в поликультуре будут значительно отличаться от ранговых распределений мысленно объединенных монокультур, можно говорить о том, что сложилось сообщество.

Было показано, что многовидовое (5-10 видов) сообщество может существовать в лабораторных условиях в течение довольно длительного времени (1-6 мес.). Судя по показателям экспоненциального рангового распределения и по времени культивирования, десятивидовое сообщество более устойчиво, чем пятивидовое (Левич и др., 1985).

Остановимся более подробно на некоторых практических рекомендациях по работе с альгологическими микрокосмами в лабораторных условиях. В экспериментах с модельными альгоценозами часто исследуется рост водорослей из разных отделов в моно- и поликультурах в зависимости от исходных концентраций биогенных элементов, света и температуры.

Для анализа роста поликультур в накопительном режиме особое значение имеет периодический контроль среды, так как концентрации веществ постоянно меняются. Кроме того, по мере роста культур в результате самозатенения клеток меняются и световые условия.

Обычно эксперимент по культивированию нескольких видов фитопланктона в сообществе начинается с выбора жидкой питательной среды. Для выращивания водорослей в лабораторных условиях существует несколько типов сбалансированных по биогенным элементам сред: среда Кратца — Майерса, среда Бенеке, среда Дота и др. (Приложение 1). Наиболее удобна среда Дота (Dauta, 1982а), которая содержит 28 мг/л азота и 6 мг/л фосфора в расчете на элемент. Иногда бывает необходимо применять модифицированную среду Дота, где исходные концентрации одних элементов (например, азота и фосфора) варьируют от опыта к опыту, а содержание других веществ остается постоянным.

Для избавления от микроорганизмов, способных составить растениям конкуренцию за пищевые ресурсы, среду предварительно автоклавируют. Для полной стерилизации, в случае минеральных сред, обычно достаточно кипячения обогащенной среды в течение 30 мин под давлением 0.5 атм. После охлаждения альгологически и бактериологически чистые культуры микроводорослей стерильно пересевают с твердых агаризованных сред, на которых они, как правило, хранятся в альгологических коллекциях, на готовую жидкую среду.

Для учета числа клеток водорослей наибольшее признание получил камерный метод, основы которого заложил Р. Кольквитц еще в 1905 г.

Измерения численности проводят в нескольких повторностях. В качестве приближенной оценки используют среднее арифметическое значение измерений.

Искажение результатов счета иногда может быть вызвано ошибкой выборки, связанной с переносом опытного материала в камеру, и ошибкой счета. Показано, что при просчете 2000-3000 клеток обеспечивается не менее чем 20%-я точность определения общей численности фитопланктона (Федоров, 1979). Это правило относится как к общему числу клеток поликультуры, так и к числу клеток данного вида или данной группы видов.

Просмотр природных фитопланктонных проб проводят на бинокулярном микроскопе в камере Нажотта. В каждой выборке просчет делают отдельно при большом увеличении, а после этого при более мелком увеличении для правильного учета клеток крупных видов. Это связано с тем, что в наиболее концентрированных пробах для поиска требуемых 2000-3000 особей хватает нескольких полос камеры, и, чтобы не пропустить редкие, но дающие заметный вклад в биомассу клетки, необходимо дополнительно просмотреть несколько камер при небольшом увеличении. Природные пробы, как правило, бедны фитопланктоном и для облегчения счета их предварительно концентрируют, отстаивая в течение недели, а затем сливая с помощью сифона верхний слой без клеток.

Полученные результаты по численности каждого идентифицированного рода или вида и суммарной численности фитопланктона пересчитываются на всю пробу, а затем на единицу объема исходной пробы (в данном случае на 1 мл) по следующей формуле:

,

— центрифугирование пробы и осаждение массы водорослей в специальных, заранее градуированных, воронках;

— прямое взвешивание на аналитических весах отфильтрованной массы (при фиксированном объеме пробы);

— измерение индивидуальных размеров (масс) клеток и дальнейший пересчет через численность в биомассу.

Индивидуальные измерения размеров организмов (клеток, ценобиев или колоний) производят под микроскопом с помощью окуляр-микрометра с предварительной его калибровкой на объект-микрометре. Для установления размеров измеряют, как правило, 50 случайно встреченных особей для массовых видов и 10 особей для редких видов. После этого вычисляют средние арифметические значения размеров и при помощи формул объемов для аппроксимирующих фигур находят массы организмов.

Биомассу рассчитывают по формуле

где n — численность данного вида, V — объем клетки или ее масса.

Индивидуальные массы клеток некоторых видов водорослей, а также формулы для расчета объемов клеток, имеющих различные формы, приведены в Приложении 2. Эти данные были получены в течение нескольких лет работы с природным фитопланктоном рыбоводных прудов Астраханской обл. Они могут быть полезны читателю в качестве справочного материала и при работе с лабораторными культурами. В табл. 2.1 приведены результаты расчета биомасс различных видов водорослей описан-

В опытах с моно- и поликультурами важную роль играют лимитирующие субстратные факторы, т.е. те виды ресурсов, исчерпание которых из среды приводит к прекращению деления клеток. Что касается фактора энергетического, которым является свет, то остановка роста возникает при достижении культурой определенной оптической плотности, пропорциональной численности клеток.

Для изучения лимитирования может быть использован метод пересевов, который достаточно прост и эффективен.

Перед постановкой эксперимента для получения необходимых концентраций азота и фосфора в среде в начале опыта клетки отмывают стерильной питательной средой без добавок азота и фосфора и выдерживают двое суток для истощения запасов этих элементов в клетках.

Начальные дозы добавок азота и фосфора выбирают такими, чтобы за сравнительно короткое время культуры достигли стационарной фазы роста.

Среди большого числа различных методик определения концентраций биогенных элементов, на наш взгляд, наибольший интерес представляют два простых способа контроля за содержанием азота и фосфора в среде.

Концентрацию фосфора мы предлагаем измерять методом Дениже — Аткинса, т.е. с помощью визуального шкалирования по шкале стандартных растворов (Ринькис, Ноллендорф, 1982). Для этого пробу фильтруют, а затем добавляют в фильтрат молибдат аммония и хлористое олово. Раствор окрашивается в синий цвет. Интенсивность окраски зависит от концентрации фосфора, измерить которую можно при сравнении с имеющимися стандартами. Этот метод прост и не требует сложного оборудования. Он вполне применим также и в полевых условиях.

В качестве иллюстрации приводим материалы по 10 сериям опытов с лабораторными альгоценозами. Материалы серий были использованы для изучения взаимодействия видов, для расчетов ресурсных потребностей клеток, для идентификации и верификации моделей функционирования сообществ, для поиска путей регулирования видовой структуры сообществ и др. Надеемся, что приведенные материалы могут быть полезны читателям в качестве первичных данных для собственных теоретических иследований.

среда 1: N — 11 мг/л, P — 3.5 мг/л;

среда 2: N — 60 мг/л, P — 3 мг/л.

Четыре ранее изучавшихся вида протококковых были исследованы в опыте №7. Это Ankistrodesmus falcatus, Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliquus и S. quadricauda. Культивирование проходило на трех средах с разным содержанием фосфора (среда 1 — 0.5 мг/л; среда 2 — 1 мг/л; среда 3 — 1.5 мг/л) и одинаковым содержанием азота — 30 мг/л. Было создано несколько альгоценозов. Поликультура из всех четырех видов росла на всех средах. Помимо этого, поликультуры из трех видов (четыре возможных сочетания) культивировали на средах с содержанием фосфора 1 мг/л. На 14-е сутки опыта, когда в среде оставалось около 20 мг/л азота, во все колбы было добавлено по 40 мг/л этого элемента, так что в конце опыта, на 30-е сутки, концентрация нитратов нигде не была нулевой.

среда 1: N — 14 мг/л; P — 3.1 мг/л; N/P = 4.5;

среда 2: N — 34 мг/л; P — 0.6 мг/л; N/P = 57;

среда 3: N — 34 мг/л; P — 0.1 мг/л; N/P = 340;

среда 4: N — 4 мг/л; P — 3.1 мг/л; N/P = 1.3.

Опыт продолжался 56 суток и в конце его было обнаружено лимитирование светом.

среда 1: N — 0.05 мг/л; P — 0.01 мг/л; N/P = 5;

среда 2: N — 0.25 мг/л; P — 0.01 мг/л; N/P = 25;

среда 3: N — 0.75 мг/л; P — 0.01 мг/л; N/P = 75;

Низкие абсолютные концентрации элементов обусловили быстрое наступление стационарной фазы (на 24-е сутки). Трехвидовая поликультура росла на всех четырех средах, а три поликультуры с попарным сочетанием видов — на двух средах (N — 0.05 и 0.75 мг/л). Малые внешние концентрации привели к тому, что количество ресурсов в среде оказалось меньше внутриклеточных запасов азота и фосфора. За счет этих приростов и осуществлялась основная часть наблюдаемого прироста численности всех видов.

Рассмотрим в качестве примера работы с поликультурами водорослей организацию и проведение 70-суточного эксперимента с 10-видовым альгоценозом (Левич и др., 1986а, опыт №1 в 2.3).

Как было указано выше, в экспериментальное сообщество были включены следующие штаммы зеленых одноклеточных водорослей:

Порядок Protococcales

Семейство Oocystaceae

1. Chlorella vulgaris (Bejerink.)

2. Scotiella nivalis (Fritsch.)

3. Chromochloris cinnoborina (Chodat.)

Семейство Scenedesmaceae

4. Scenedesmus quadricauda (Turp.)

5. Scenedesmus bijugatus (Lagerh.)

6. Scenedesmus obliquus (Kruger.)

Семейство Coelastraceae

7. Ankistrodesmus acicularis (Korschik.)

8. Ankistrodesmus braunii (Brunnth.)

Порядок Ulothrichales

9. Stichococcus mirabilis (Lagerh.)

Порядок Volvocales

10. Chlamydomonas humicola (Luksch.)

Виды для совместного культивирования подбирались с учетом следующих условий:

1. Физиологическое сходство, гарантирующее возможность культивирования при близких температурах, соленостях, концентрациях ионов водорода и биогенных элементов.

2. Отсутствие в литературе данных об антагонистических взаимодействиях (или наличие данных о неантагонистических взаимоотношениях, см. например: Якубов, Таубаев, 1969; Эргашев, Таубаев, 1969; Телитченко и др., 1972; Паламар-Мордвинцева и др., 1972; Kroes, 1972; Мелешко, 1974).

4. Морфологическая различимость совместно культивируемых видов, необходимая для успешного микроскопирования поликультур.

Размеры клеток и численности определялись под микроскопом МБИ-11 с помощью винтового объект-микрометра и камеры Горяева.

В работе как для непосредственно измеряемых в нескольких повторностях величин (численности и размеры клеток, концентрация биогенов, первичная продукция), так и для рассчитываемых характеристик (объемы и биомассы клеток, скорости роста и потребления, индексы разнообразия и потребления и др.) оценивались погрешности измерений и доверительные интервалы. Для определения средних размеров одновременно измерялись параметры 60-100 клеток. Измерения концентраций фосфатов и нитратов были проведены в трех сериях из 9 параллельных гидрохимических проб, а измерения первичной продукции — в одной серии из 16 параллельных проб (кроме того, каждая из величин первичной продукции является усреднением по трем повторностям, требуемым методикой измерений первичной продукции с помощью радиоуглеродного метода).

Оценка погрешностей численности (и дополнительная оценка погрешностей в определении биогенных элементов и первичной продукции) проводилась посредством обработки результатов для повторностей поликультур — шести повторностей при высокой освещенности и трех — при низкой.

Размеры клеток и погрешности их измерения приведены в табл. 2.1.

Относительные погрешности гидрохимических определений составляют:

по сериям параллельных проб 2-6% для нитратов, около 20% для фосфатов при низких концентрациях (0.5-2 мг/л) и 1% при более высоких концентрациях (5-40 мг/л);

по повторностям в поликультуре (25-е сут опыта, около 240 мг/л нитратов и около 1.5-5 мг/л фосфатов) — 3-4% для нитратов и 2-8% для фосфатов.

Относительные погрешности в подсчете численности видов в поликультуре, вычисленные по повторностям (25-е сут опыта), составляют в среднем 11% для повторностей при высокой освещенности и около 5% для повторностей при низкой освещенности (табл. 2.2). Погрешности при подсчете числа клеток в монокультурах заведомо не превышают погрешностей для поликультур. Погрешности для рассчитываемых, а не измеряемых непосредственно величин вычислялись по обычным формулам теории ошибок для погрешности суммы, произведения и т.д.

Описываемый опыт с поли- и монокультурами продолжался около 70 суток, в течение которых на 0-е, 3-и, 11-е, 25-е, 39-е, 59-е и 68-е сутки отбирались пробы для гидрохимических и гидробиологических определений.

Рис. 2.1, 2.2 иллюстрируют динамику роста и потребления фосфатов в обеих поликультурах для каждого вида, а рис. 2.3 представляет рост в поликультурах при двух уровнях освещенности и в монокультуре для одного из видов.

Анализируя динамику роста и потребления, можно сделать следующие выводы:

2. В поликультуре на свету экспоненциальная фаза началась к 11-м и закончилась к 39-м суткам опыта в связи с исчерпанием запаса фосфора. Заметим, что начальная обеспеченность фосфором (отношение исходной его концентрации к начальной биомассе) в монокультуре в среднем на порядок превышала обеспеченность в поликультуре, поскольку при составлении поликультуры смешивались 10 инокулятов монокультур, а среды для опытов были одинаковые.

3. В поликультуре, содержавшейся при низкой освещенности, экспоненциальная фаза длилась приблизительно с 11-х по 59-е сут опыта.

Указанные наблюдения позволяют для дальнейшего анализа выбрать промежуток между 25-ми и 39-ми сут опыта, поскольку для всех культур этот промежуток соответствует экспоненциальной фазе роста (для дополнительного обсуждения можно привлекать промежуток с 11-х по 25-е сутки для поликультур и с 39-х по 59-е сут — для монокультур). В табл. 2.3, 2.4, 2.5 для указанных промежутков приведены скорости роста ви-видов, вычисленные по формулам

— логарифмическая скорость роста численности,

— логарифмическая скорость роста биомассы,

— логарифмическая скорость потребления фосфора.

Попытаемся на основе анализа динамики и кинетики роста водорослей сделать выводы о том, в какой степени удалось решение задачи о создании многовидового экспериментального альгоценоза. При этом нужны критерии для оценки жизнеспособности исследуемого конгломерата клеток.

Одним из таких критериев может быть отсутствие элиминации или хотя бы вытеснения некоторых видов. По такому критерию следует заключить, что экспериментальное сообщество существует, поскольку в течение всего опыта ни один вид не только не исчез, но и не уменьшил свою первоначальную численность. Более жестким критерием устойчивости сообщества могло бы быть требование отсутствия подавления роста видов: мы видим, что биомассы не убывают, но следует выяснить, достаточно ли хорошо растут эти виды.

Следует сделать вывод о том, что в световой поликультуре часть видов (4 из 10) существовала в подавленном состоянии. Возможная причина, видимо, состоит в их метаболитном подавлении, поскольку в темновой поликультуре (при более низкой плотности клеток) эти водоросли растут примерно так же, как и остальные. Может быть, аналогичная причина — метаболитное стимулирование — приводит к улучшенному росту ряда видов (A. braunii, S. quadricauda) в световой поликультуре в сравнении с монокультурой, несмотря на более низкую обеспеченность биогенными элементами.